1，什么是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染？ 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染：外源片段的表達(dá)時(shí)間短暫。這主要是因?yàn)橥庠磳?dǎo)入的裸露的載體整合入基因組的幾率非常低，所以以染色體外(episomal)形式存在，不能隨細(xì)胞分裂而一同復(fù)制導(dǎo)致最后拷貝數(shù)被稀釋導(dǎo)致的。而且考慮到細(xì)胞分裂會(huì)稀釋質(zhì)粒的量，所以起初轉(zhuǎn)染的質(zhì)?？截悢?shù)*。這就導(dǎo)致瞬時(shí)轉(zhuǎn)染呈現(xiàn)一個(gè)高拷貝到低拷貝迅速降低的過(guò)程，且無(wú)法在這個(gè)系統(tǒng)上實(shí)現(xiàn)可誘導(dǎo)表達(dá)。
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：是相對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染而言，進(jìn)入細(xì)胞的質(zhì)粒整合入細(xì)胞基因組中，并能隨細(xì)胞分裂穩(wěn)定傳遞下去。在這個(gè)系統(tǒng)中，質(zhì)粒表達(dá)穩(wěn)定，拷貝數(shù)低，且能實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并不是一種與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染不同的方法，只是對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行篩選，得到穩(wěn)定整合的細(xì)胞株。穩(wěn)定整合的幾率因基因傳遞的方法而異，跨度可以從10-8到10-1。因此，對(duì)于有的轉(zhuǎn)染方法，比如化學(xué)試劑介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，其整合幾乎可以忽略不計(jì)。質(zhì)粒載體整合的位點(diǎn)并不是*隨機(jī)分布，依據(jù)不同的基因傳遞方法，呈現(xiàn)不同的靶向傾向性，所以是一種半隨機(jī)整合。
2，設(shè)計(jì)穩(wěn)定株構(gòu)建實(shí)驗(yàn)需要考慮的因素有哪些？
穩(wěn)定整合試驗(yàn)中需要考慮的幾個(gè)關(guān)鍵因素有：
1)，外源插入片段的拷貝數(shù)。多數(shù)情況下，低拷貝甚至是單拷貝可以減少人為實(shí)驗(yàn)因素的干擾。
2)，整合的幾率，這不僅決定了穩(wěn)定株篩選的難易程度，而且還可以幫助人們更容易得到混合穩(wěn)定株。
3)，整合位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄活躍度，決定了穩(wěn)定株中外源片段的表達(dá)質(zhì)量。理想的狀況是單拷貝，但轉(zhuǎn)錄活性比較高。
4)，整合后的穩(wěn)定性。不同的整合位點(diǎn)決定了外源片段在染色體中的穩(wěn)定性，有些區(qū)域易發(fā)生重組或者丟失，從而導(dǎo)致穩(wěn)定株再次丟失的情況。
5)，最好使用混合穩(wěn)定株或者獲得多個(gè)不同單克隆穩(wěn)定株。因?yàn)榉€(wěn)定整合往往伴隨這插入失活宿主內(nèi)源基因，所以實(shí)驗(yàn)時(shí)通過(guò)使用混合穩(wěn)定株，或者對(duì)多個(gè)單克隆穩(wěn)定株進(jìn)行比較，可以幫助研究人員獲得更精確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
3，什么時(shí)候需要穩(wěn)定細(xì)胞株？
以下實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株而不是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染更能滿足實(shí)驗(yàn)要求：
1)，外源片段在分裂細(xì)胞中長(zhǎng)期(>2周)穩(wěn)定表達(dá)。雖然普通轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)一般只能保證2-4天的轉(zhuǎn)染和表達(dá)效率，但腺病毒載體在多數(shù)分裂細(xì)胞中可以維持2-4周內(nèi)的高轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)周期。而非分裂細(xì)胞，可以使用腺相關(guān)病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因，因?yàn)橄傧嚓P(guān)病毒載體在許多非分裂細(xì)胞中可以保持長(zhǎng)達(dá)1年的高效表達(dá)。
2)，需要構(gòu)建使用誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，這主要是由于：a)，過(guò)表達(dá)基因或者干擾目的基因引起細(xì)胞毒性或者抑制細(xì)胞生長(zhǎng)等不利因素;b)，目的基因的過(guò)表達(dá)或者干擾需要時(shí)空特異性。
3)，希望控制目的基因過(guò)表達(dá)或者干擾的拷貝數(shù)，以避免引入人為因素影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確性。構(gòu)建穩(wěn)定株可以幫助篩選拷貝數(shù)適量的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。
4)，部分細(xì)胞種類，病毒載體亦無(wú)法達(dá)到高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定株，達(dá)到外源片段的高效表達(dá)。
5)，長(zhǎng)期在少數(shù)幾類細(xì)胞中研究幾個(gè)基因的功能，通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定株，可以大大降低頻繁轉(zhuǎn)染或者病毒包裝的成本，也大大方便實(shí)驗(yàn)研究。
6)，部分蛋白穩(wěn)定性*，瞬時(shí)RNA干擾因?yàn)樽饔弥芷诙?，只能抑制目的基因的表達(dá)，但無(wú)法去除已經(jīng)表達(dá)的目的蛋白，所以需要通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定株實(shí)現(xiàn)更好的基因干擾效果。
7)，需要往動(dòng)物體內(nèi)注射表達(dá)有外源片段的細(xì)胞。需要構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株，以防止注射入動(dòng)物體內(nèi)后，很快外源片段表達(dá)丟失。
8)，細(xì)胞個(gè)體差異(同一類細(xì)胞，不同個(gè)體細(xì)胞基因組存在差異)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有干擾，需要構(gòu)建單克隆細(xì)胞株去除干擾。
9)，需要將外源片段插入基因組中，比如基因敲除，基因插入突變篩選等修飾基因組的實(shí)驗(yàn)。
4，什么時(shí)候不需要構(gòu)建穩(wěn)定株？
以下實(shí)驗(yàn)不需要構(gòu)建穩(wěn)定株：
1)，希望迅速觀察目的基因過(guò)表達(dá)或者干擾效果。例如在正式實(shí)驗(yàn)之前進(jìn)行的小規(guī)模預(yù)實(shí)驗(yàn)。
2)，2-4天的瞬時(shí)表達(dá)已經(jīng)可以達(dá)到具體的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，比如檢測(cè)兩個(gè)外源轉(zhuǎn)染的目的蛋白之間的相互作用，或者觀察某些細(xì)胞周期抑制，凋亡或細(xì)胞存活相關(guān)基因的細(xì)胞表型。
3)，細(xì)胞個(gè)體差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響。體外培養(yǎng)非原代細(xì)胞，多為轉(zhuǎn)化細(xì)胞系或者癌細(xì)胞，細(xì)胞個(gè)體差異大，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或者使用腺病毒/腺相關(guān)病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)更可以反映細(xì)胞群體行為?；蛘呤褂媚孓D(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建混合穩(wěn)定株。
5，病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株有什么優(yōu)勢(shì)？
化學(xué)試劑介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法和電轉(zhuǎn)，整合率低，同時(shí)整合位點(diǎn)不穩(wěn)定，易發(fā)生再次丟失的情況，而且整合位點(diǎn)一般都在轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)之外，所以并不是理想的穩(wěn)定整合工具。另外，整合后的拷貝數(shù)是由核內(nèi)的外源DNA局部濃度，而不是轉(zhuǎn)染時(shí)的DNA的量決定，而化學(xué)方法在輸入質(zhì)粒載體入核的效率比電轉(zhuǎn)和病毒載體相比要低得多，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)染相同細(xì)胞所用質(zhì)粒載體用量要大大高于其它方法，造成入核質(zhì)粒載體量難以控制，這也解釋了為什么化學(xué)轉(zhuǎn)染方法和其它兩種方比，更傾向于得到串聯(lián)多拷貝。以上種種因素，導(dǎo)致使用非病毒載體轉(zhuǎn)染方法構(gòu)建穩(wěn)定株，成功率低，穩(wěn)定性差，穩(wěn)定克隆株易出現(xiàn)不均一(含有非整合細(xì)胞)等缺點(diǎn)。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體由于整合率高，是非常理想的穩(wěn)定株構(gòu)建工具。而且通過(guò)控制逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)條件，理論上可以確保每個(gè)細(xì)胞只有單拷貝插入。同時(shí)由于病毒載體是通過(guò)病毒重組酶將外源片段整合入染色體中，其整合特性和病毒自身整合特性非常相似：偏向于轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)段，且整合后非常穩(wěn)定，在傳代100次后仍然保留在宿主基因組中。最重要的是整合幾率和所有其它化學(xué)，物理轉(zhuǎn)染方法比，增加5至6個(gè)數(shù)量，使得穩(wěn)定株構(gòu)建不再成為實(shí)驗(yàn)研究的障礙。由于整合幾率非常高，所以很容易獲得混合穩(wěn)定株。
腺病毒載體整合率和普通轉(zhuǎn)染方法差異不大，被認(rèn)為是不能整合的一類病毒載體，因此相關(guān)研究數(shù)據(jù)較少，不建議用來(lái)構(gòu)建穩(wěn)定株。非野生型腺相關(guān)病毒載體(Rep-)整合率較低，但因?yàn)橐吧筒《据d體可以定點(diǎn)將病毒基因組整合于人19號(hào)染色體，所以從安全性和穩(wěn)定性角度來(lái)說(shuō)，潛力都非常巨大。由于諸多因素，研究人員仍然在對(duì)其進(jìn)行改造中，包括考慮到嚙齒類動(dòng)物不含有人19號(hào)染色體對(duì)應(yīng)的整合位點(diǎn)序列。
6，篩選穩(wěn)定細(xì)胞株的方法主要有哪些？
主要有三類方法：
1)單克隆環(huán)法：此類方法多用于整合率低的轉(zhuǎn)染方法或者需要得到單克隆細(xì)胞株的實(shí)驗(yàn)。其優(yōu)點(diǎn)在于工作量小，只需將轉(zhuǎn)染或者病毒載體感染后的細(xì)胞按照一定的細(xì)胞密度轉(zhuǎn)移至新皿中，并使用合適的藥物進(jìn)行篩選，最后在克隆環(huán)的幫助下對(duì)單克隆細(xì)胞株進(jìn)行挑選，并在新皿中完成擴(kuò)增。缺點(diǎn)在于需要對(duì)細(xì)胞密度和藥物濃度繪制致死曲線并選取合適的細(xì)胞密度和藥物濃度進(jìn)行篩選，一些細(xì)小的密度和濃度差別都會(huì)導(dǎo)致難以獲取均一的單克隆，結(jié)果導(dǎo)致獲取的克隆不純，含有非整合的細(xì)胞。穩(wěn)定整合的細(xì)胞在這樣一類混合細(xì)胞中，很快會(huì)失去生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，最終導(dǎo)致失去穩(wěn)定株。2)96孔單克隆稀釋法：此類方法同樣多用于整合率低的轉(zhuǎn)染方法或者需要得到單克隆細(xì)胞株以及篩選懸浮細(xì)胞穩(wěn)定株的實(shí)驗(yàn)。其優(yōu)點(diǎn)在于，理論上可以得到非常均一的單克隆，同時(shí)可以篩選懸浮細(xì)胞穩(wěn)定株。其缺點(diǎn)在于，工作量比較大。
3)逆轉(zhuǎn)錄病毒混合克隆制備法：此類方法適用于需要制備混合穩(wěn)定株。優(yōu)點(diǎn)在于可以在短時(shí)間內(nèi)(1周)獲得穩(wěn)定細(xì)胞株，同時(shí)也可以隨時(shí)將細(xì)胞稀釋轉(zhuǎn)移至新皿中獲得單克隆細(xì)胞株。缺點(diǎn)在于需要制備逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
7為什么常規(guī)轉(zhuǎn)染方法篩選穩(wěn)定株異常困難？
常規(guī)化學(xué)轉(zhuǎn)染或者電轉(zhuǎn)方法，其整合是非同源重組隨機(jī)整合，幾率非常低(10-8-10-6)，且這些轉(zhuǎn)染條件下發(fā)生的整合多發(fā)生在轉(zhuǎn)錄非活躍區(qū)或者重復(fù)序列區(qū)，導(dǎo)致外源片段表達(dá)效率低，同時(shí)這些整合常常不穩(wěn)定，隨著傳代次數(shù)的增加，即使在有壓力選擇的情況下也容易發(fā)生丟失。
8，為什么病毒載體介導(dǎo)的穩(wěn)定株篩選方法效率要比常規(guī)方法高？
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的染色體整合依賴于病毒重組酶，是一個(gè)酶催化反應(yīng)，因此效率相比隨機(jī)整合要高多個(gè)數(shù)量級(jí)。而且整合位點(diǎn)多位于轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)，因此表達(dá)效率高。同時(shí)其整合非常穩(wěn)定，連續(xù)傳代100代以上仍然保持穩(wěn)定表達(dá)。
9,如何選擇適合的病毒包裝類型進(jìn)行穩(wěn)定株篩選？
并非所有的病毒載體都適合用來(lái)進(jìn)行穩(wěn)定株篩選，首先需要挑選整合效率高，整合位點(diǎn)穩(wěn)定的病毒載體。至今為止，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是*的可以介導(dǎo)基因整合的病毒載體。其次，依據(jù)具體實(shí)驗(yàn)要求，挑選不同整合位點(diǎn)傾向性的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。傾向于整合于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的，容易造成下游基因的激活;而整合于轉(zhuǎn)錄活躍基因內(nèi)的，容易導(dǎo)致整合區(qū)基因的插入失活。
10,病毒載體介導(dǎo)的穩(wěn)定株篩選方法可以適用于任何靶細(xì)胞嗎？
雖然普通的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以用來(lái)進(jìn)行穩(wěn)定株的構(gòu)建，然而這一類病毒載體并不能高效感染非分裂細(xì)胞，因此對(duì)于這一類分化細(xì)胞，可以使用慢病毒載體進(jìn)行穩(wěn)定株構(gòu)建。也可以使用腺相關(guān)病毒載體高效感染非分裂細(xì)胞，這一類病毒載體雖然整合率低于慢病毒載體，但其可以以染色體外形式長(zhǎng)期(數(shù)月至數(shù)年)存在于非分裂細(xì)胞中，因此可以避免進(jìn)行穩(wěn)定株篩選。
11,為什么穩(wěn)定株構(gòu)建服務(wù)中不使用腺病毒載體？
腺病毒載體由于其整合幾率極低，被普遍認(rèn)為是不具備整合能力的病毒載體，所以一般不用來(lái)進(jìn)行穩(wěn)定株構(gòu)建。
12,單克隆穩(wěn)定株和混合克隆穩(wěn)定株有什么區(qū)別？我該選擇哪一類用于我的實(shí)驗(yàn)？
單克隆穩(wěn)定株顧名思義來(lái)源于含有穩(wěn)定整合外源片段的單個(gè)細(xì)胞的擴(kuò)增，而混合穩(wěn)定株則由多個(gè)單克隆穩(wěn)定株構(gòu)成的克隆群，不同的單克隆其外源片段的整合位點(diǎn)不一樣。由于體外細(xì)胞多屬于細(xì)胞系，其基因組呈現(xiàn)不穩(wěn)定的特點(diǎn)，因此即使是同類細(xì)胞，不同細(xì)胞個(gè)體基因組背景都存在差異。當(dāng)需要去除細(xì)胞群體干擾因素的時(shí)候，推薦使用單克隆穩(wěn)定細(xì)胞株，其基因組背景相對(duì)單一，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果干擾因素小。當(dāng)進(jìn)行系統(tǒng)生物學(xué)研究時(shí)，多考慮這類因素。同時(shí)也是由于不同細(xì)胞個(gè)體差異大，而且不同整合位點(diǎn)的單克隆細(xì)胞株表現(xiàn)出來(lái)的細(xì)胞行為可能不一致，所以許多實(shí)驗(yàn)使用混合克隆株更能去除細(xì)胞間差異造成的干擾?；旌戏€(wěn)定株可以通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒直接篩選獲得，或者通過(guò)講眾多不同的單克隆穩(wěn)定株混合獲得。前者無(wú)論是是從質(zhì)量，還是時(shí)間周期來(lái)看都更好。
13,怎么判別篩選的穩(wěn)定株是單克隆？
1)，如果外源片段含有熒光標(biāo)記，可以直接使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其熒光是否均一;如果還有其它標(biāo)簽，可以進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記，再使用流式細(xì)胞儀觀察熒光分布是否出現(xiàn)均一峰值。因?yàn)椴煌瑔慰寺∮捎谡衔稽c(diǎn)不一樣，其表達(dá)強(qiáng)度也會(huì)受附近染色體結(jié)構(gòu)的影響，出現(xiàn)差異。
2)，如果外源片段不含任何標(biāo)簽或者熒光標(biāo)記，則可以使用分子生物學(xué)比如SouthernBlot的方法鑒定。
3)，使用96孔板稀釋法篩選，得到的陽(yáng)性克隆一般是單克隆。因?yàn)樽畛跞绻煊蟹钦霞?xì)胞，則含有整合外源片段的單細(xì)胞多半會(huì)失去生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，無(wú)法得到陽(yáng)性克隆。使用單克隆環(huán)法，如果挑取的是致密，單一的克隆，那么多半也是單克隆。
14，如何判別篩選的穩(wěn)定株是100%含有外源整合片段的細(xì)胞群？
通過(guò)觀察所攜帶的熒光標(biāo)記或者對(duì)外源插入片段進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記可以判斷穩(wěn)定株是否混有非整合細(xì)胞。
15，為什么有的時(shí)候構(gòu)建RNAi穩(wěn)定株對(duì)達(dá)到高效的基因干擾效果是必須的？
RNA干擾效應(yīng)主要是影響目的基因所表達(dá)的mRNA的穩(wěn)定性或者翻譯，并不影響已經(jīng)存在的目的蛋白的狀態(tài)。部分蛋白其穩(wěn)定性異常高，即使mRNA的表達(dá)水平或者翻譯受到干擾，目的蛋白仍然可以在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)發(fā)揮功能。因此需要進(jìn)行穩(wěn)定株篩選，以挑取干擾效果好的細(xì)胞克隆進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在一些情況下，甚至需要進(jìn)行第2輪穩(wěn)定株篩選，才能獲得一個(gè)比較好的RNAKnockdown細(xì)胞株。
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